Cefotiam ức chế giai đoạn liên kết chéo cuối cùng của sản xuất peptidoglycan, do đó ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Nó có hoạt tính tương tự hoặc ít hơn với staphylococci và streptococci gram dương, nhưng kháng với một số beta-lactamase được sản xuất bởi vi khuẩn gram âm. Nó hoạt động mạnh hơn chống lại nhiều loài Enterobacteriaceae bao gồm Enterobacter, E. coli, Klebsiella, Salmonella và các loài Proteus dương tính với indole.

Trong sử dụng lâm sàng, nồng độ cao của cefotiam được quan sát thấy ở một số mô (thận, tim, tai, tuyến tiền liệt và đường sinh dục), cũng như trong chất lỏng và dịch tiết (mật, dịch ascitic).